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Sequenzanalyse nach Sanger - eine verständliche Erklärung

Im Jahr 1977 wurde das erste Genom eines Bakteriophagen (Virus, welches Bakterien infiziert) sequenziert. Dadurch wurde die genaue Basenabfolge der Virus-DNA aufgedeckt. Heute, nur wenige Jahrzehnte später, sind dank neuester Sequenzanalysen sogar die Genome komplexer Organismen wie des Menschen vollständig bekannt. Die ursprüngliche Sequenzierung wurde von Sanger und Coulson entwickelt und wird auch als Kettenabbruch-Synthese bezeichnet. Doch wie funktioniert die Sequenzanalyse nach Sanger eigentlich im Detail?

Mit der Sequenzanalyse nach Sanger lässt sich die Basenfolge der DNA ermitteln.
Mit der Sequenzanalyse nach Sanger lässt sich die Basenfolge der DNA ermitteln.

Für das Kettenabbruchverfahren benötigt man einzelsträngige DNA. Diese zu sequenzierende Nukleinsäure wird in einen Vektor eingebaut. Danach werden in verschiedenen Reaktionsschritten daran spiegelbildlich passende DNA-Stränge mit unterschiedlichen Längen synthetisiert.

Kettenabbruchverfahren – Die klassische Sequenzanalyse nach Sanger-Coulson

  1. Zuerst wird der zu sequenzierende DNA-Abschnitt enzymatisch in den M13-Vektor eingebaut. Hinzu kommen ein DNA-aufbauendes Enzym (Polymerase) sowie ein kurzes Oligonukleotid, welches nur einige wenige Basenpaare lang ist. Dies ist der Startpunkt für die Strangsynthese des spiegelbildlichen DNA-Stranges.
  2. Im nächsten Schritt der Sequenzanalyse nach Sanger setzt man der Reaktion je eines von vier Didesoxynukleotiden hinzu. Diese sind radioaktiv oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und gleichen sonst den natürlicherseits beim DNA-Aufbau genutzten Nukleotiden Adenosin, Cytidin, Thymidin und Guanosin. Anders als ihre natürlichen Gegenspieler haben die Didesoxynukleotide keine 3‘-OH-Gruppe. Diese ist jedoch nötig, um einen DNA-Strang fortlaufend aufzubauen, d. h. das nächste Nukleotid mit dem Ende des Stranges zu verknüpfen. In der Folge bricht die Strangsynthese nach dem Einbau eines Didesoxynukleotids ab. Dieser Abbruch ist namensgebend für das Kettenabbruchverfahren.
  3. Es ist nicht vorhersehbar, wann ein Didesoxynukleotid in den neuen DNA-Strang eingebaut wird und zum Abbruch führt. Daher entstehen in jedem der vier Reaktionsansätze unterschiedlich lange DNA-Bruchstücke, die auf einem Didesoxy-Adenosin, -Cytidin, -Thymidin oder -Guanosin enden.

Sequenzanalyse nach Sanger – Das Ergebnis

Zum Abschluss der klassischen Sequenzanalyse nach Sanger erhält man vier Reaktionen mit jeweils einem Gemisch aus DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge. Diese Gemische werden nach Adenosin, Cytidin, Thymidin und Guanosin getrennt auf einem Gel oder in Kapillaren aufgespalten. Da die Didesoxynukleotide radioaktiv oder mittels verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe (rot, grün, blau, gelb) markiert sind, können die DNA-Fragmente sichtbar gemacht werden. Die Informationen werden von einem Laser und Detektor erfasst, und ein Computer errechnet anschließend aus den Fluoreszenzdaten die genaue Abfolge der Basen im DNA-Molekül. So erhält der Wissenschaftler die Darstellung der Basenfolge (Sequenz) im zu untersuchenden Genom.

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